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INDAGINE PRELIMINARE SULL'EFFICACIA DELL'ESTRATTO DI SEMI DI POMPELMO NELLA LOTTA CONTRO LA PESTE AMERICANA

L'Apis n.2 - 2003

La peste americana è una malattia sostenuta dal batterio Paenibacillus larvae subsp. larvae che colpisce la covata causando un'alta mortalità delle larve. Questa patologia porta alla distruzione delle colonie, anche se sono documentati casi in cui le colonie, dopo aver mostrato lievi segni della malattia, si sono riprese per un periodo indefinito. Le spore sono trasmesse dalle api adulte alle larve durante le operazioni di pulizia dei favi e durante le operazioni di nutrizione delle larve, quindi il comportamento igienico della famiglia può giocare un ruolo importante nel decorso della malattia.
I mezzi di lotta possono essere molteplici; da azioni radicali, come la distruzione delle colonie, a mezzi chemioterapici come il trattamento con sulfatiazolo e ossitetracicline che determinano però problematiche legate alla residualità nel miele. Appare evidente, quindi, l'importanza dell'utilizzo di sostanze o prodotti alternativi e/o naturali che riducano al minimo l'impatto con la salubrità degli alimenti (2, 3).
E' noto che l'estratto di semi di pompelmo ha potere battericida e soluzioni commerciali hanno dimostrato che è attivo nei confronti di numerosi germi quali Salmonella spp, E. coli, Listeria monocytogenes e Candida albicans. L'effetto inibente è dovuto principalmente ad alterazioni della membrana cellulare con inibizione della respirazione cellulare e conseguente modificazione della permeabilità della cellula (1,5,8,10).
L'obiettivo di questo lavoro è verificare in laboratorio la capacità inibente dell'estratto nei confronti del Paenibacillus larvae subsp larvae e poi misurarne l'efficacia "in campo" su alveari infettati sperimentalmente.

MATERIALI E METODI

Prove di inibizione in vitro
La capacità inibente dell'estratto di semi di pompelmo è stata testata in vitro nei confronti del Paenibacillus larvae subsp larvae, Bacillus subtilis BGA, B. cereus 11778, B. cereus K250 e Micrococcus luteus 9341.a, secondo la procedura IZS TE B3.1.2 SOP009. L'estratto di pompelmo è stato saggiato a concentrazioni scalari con acqua distillata sterile ed in base alla misura dell'alone di inibizione ne è stata valutata la capacità inibente.

Preparazione della brodocoltura per l'infezione
Il ceppo batterico utilizzato per l'infezione, Paenibacillus larvae subsp. larvae ATCC 9545, è stato coltivato secondo la procedura IZS TE B 5.1.1 SOP 003. La pasta batterica ottenuta è stata titolata secondo la procedura IZS TE B3.1.2 SOP003 e successivamente diluita fino ad ottenere una concentrazione finale di 10 miliardi di spore/ml ( 9 ).
Per l'infezione, ad ogni alveare, sono stati somministrati, sotto forma di spray, 60 ml di sospensione formata da 30 ml di brodocoltura batterica e 30 ml di soluzione zuccherina al 25% ( 4,6 ).

Modello sperimentale
La prova sperimentale è stata svolta a Campagnatico, località della maremma toscana a 275 metri s.l.m. in provincia di Grosseto, utilizzando un apiario di 31 alveari in arnie Dadant-Blatt.
La sperimentazione si è svolta dalla metà del mese di settembre 2002 per terminare alla fine del mese di novembre 2002.
All'inizio della sperimentazione le famiglie sono state controllate e di ciascuna ne è stata valutata la forza, la potenzialità produttiva, la raccolta del polline, la raccolta del propoli e l'aggressività.
E' stata valutata, inoltre, la capacità igienica delle famiglie in quanto questo parametro può considerarsi importante nell'aiutare il risanamento di un alveare durante il trattamento terapeutico (i risultati saranno oggetto di prossima pubblicazione).
L'apiario è stato diviso in due gruppi:
o 21 famiglie sane sono state infettate sperimentalmente con 300 miliardi di spore/alveare con spray distribuito sul lato di ogni favo (contrassegnate dal n.1 al n.21) (4,7).
o 10 famiglie con infezione naturale diagnosticata mediante visita clinica (contrassegnate dal n. 22 al n.31)
Per verificare lo stadio di infezione sono stati effettuati campionamenti di favi di covata a distanza di 20 e 40 giorni dall'inizio dell'esperimento.

Prove sperimentali in apiario: trattamenti
Prima del trattamento sperimentale sono state eseguite alcune prove preliminari al fine di determinare la concentrazione ottimale del principio terapeutico, eventuali fenomeni di tossicità per le api e la sua appetibilità in funzione della forma di somministrazione (candito, soluzione zuccherina, acqua).
Sono stati formati tre gruppi mediante estrazione a sorte:

Primo gruppo: 10 alveari, di cui 7 infettati sperimentalmente e 3 con infezione naturale, sono stati trattati con olio di estratto di semi di pompelmo (2 g in 50 ml di soluzione zuccherina al 50%/alveare per 3 volte a distanza di 7 giorni). La sospensione è stata spruzzata sui favi coperti dalle api.

Secondo gruppo: 10 alveari, di cui 7 infettati sperimentalmente e 3 con infezione naturale, sono stati trattati con polvere di estratto di semi di pompelmo (2 g in 50 ml di soluzione zuccherina al 50%/alveare per 3 volte a distanza di 7 giorni). La sospensione è stata spruzzata sui favi coperti dalle api.
Terzo gruppo: 7 alveari, di cui 3 infettati sperimentalmente e 4 con infezione naturale, sono stati trattati con Sulfatiazolo (1 g in 300 ml di soluzione zuccherina al 50%/alveare per 3 volte a distanza di 7 giorni).
Quattro alveari sono stati esclusi dai trattamenti in quanto una famiglia era diventata orfana mentre le restanti tre erano risultate sempre negative all'esame batteriologico dei primi due campionamenti.
Alla fine dei tre trattamenti sono stati prelevati porzioni di favo di covata, su telaini diversi, per la ricerca di Paenibacillus larvae subsp larvae. Negli alveari dove la covata era assente la ricerca è stata eseguita sul miele.

RISULTATI
La tabella 1 mostra i risultati dei test di inibizione in vitro dell'estratto di pompelmo. Come si nota la capacità inibente del prodotto, sia sotto forma oleosa sia in polvere, nei confronti del Paenibacillus larvae subsp larvae è risultata maggiore rispetto a quella degli altri ceppi. Infatti il prodotto tal quale e quello diluito mostrano una capacità inibente quasi doppia nei confronti degli altri germi; in particolare la forma oleosa alla diluizione di 1:80 presenta un alone di inibizione pari a 8 mm di diametro rispetto ai 3 mm degli altri ceppi.
I risultati del primo campionamento, effettuato dopo 20 giorni dall'infezione per verificare la capacità infettante delle spore, sono riportati nella tabella n.2.
Ovviamente, gli alveari con infezione naturale sono risultati tutti positivi all'esame batteriologico mentre su 21 alveari infettati sperimentalmente 15 sono risultati positivi e 6 negativi con una percentuale di positività del 71%. Dai risultati del secondo campionamento, effettuato dopo 40 giorni dall'infezione, si evince che i positivi sono passati da 15 a 18 alveari su un totale di 21 incrementando la positività all'86%. All'esame ispettivo le famiglie infettate sperimentalmente presentavano i sintomi della peste americana: covata infossata, opercolatura leggermente aperta, larve filamentose alla prova dello stecchino e classico odore di putrefazione.

CONSIDERAZIONI E CONCLUSIONI
Sulla base dei risultati di laboratorio e della sperimentazione in campo è possibile formulare alcune considerazioni:

• nessuna famiglia è morta di peste americana
• al termine della sperimentazione è stata valutata di nuovo la forza delle famiglie: tutte mostravano uno stato generale buono con api su 4/7 telaini, avevano buona scorta di polline e la covata non mostrava nessun segno di patologia riferibile a peste
• dovrà essere approfondito e meglio valutato il rapporto tra il comportamento igienico della famiglia e l'efficacia dimostrata dal prodotto sperimentato
• nonostante l'elevato numero di spore somministrato (300 miliardi/alveare) non tutte le famiglie si sono infettate
• l'olio di estratto di pompelmo somministrato con candito o soluzione zuccherina si è dimostrato poco appetibile per le api
• il prodotto sembra che manifesti la stessa efficacia sia negli alveari infettati sperimentalmente sia in quelli con infezione naturale
• mettendo in relazione l'unica positività avuta e la capacità inibente dimostrata in vitro sembrerebbe esserci una differenza tra la forma fisica del prodotto indicando una maggiore efficacia di quella oleosa rispetto a quella in polvere (dato da verificare).

Non sembra opportuno trarre delle conclusioni generalizzate da questo studio pilota.
E' meglio pensare che la sperimentazione effettuata possa essere una traccia importante per lo sviluppo di un progetto interregionale che comprenda un numero cospicuo di alveari, l'integrazione con altri eventuali fattori come la capacità igienica della famiglia, tempi e situazioni climatiche delle diverse regioni e controllo della linea genetica delle regine.
Solo attraverso uno studio articolato si potranno avere risultati che potranno essere di aiuto nel trattamento della peste americana nell'ambito di una apicoltura biologica al fine di commercializzare prodotti di qualità.

(1) Langella V.; (1) Semprini P.; (1) Di Fabio F.; (1) Calvarese S.; (2) Pasini B.; (2) Falda M.T.; (3) Panella F.
(1) Istituto Zooprofilattico Sperimenta Abruzzo e Molise "G. Caporale" Teramo
(2) Apicoltura Pasini Campagnatico (GR)
(3) Unione Nazionale Associazioni Apicoltori Italiani

RINGRAZIAMENTI
Si ringrazia il Dott. J. Vitalis per la disponibilità del prodotto, il Dr. Agostino Di Marco e il Sig. Sebastiano Mancini per il tempo dedicato alla sperimentazione e ai tecnici di "Apicoltura Pasini" per la conduzione dell'apiario.