PERCHÉ IL MIELE FERMENTA?
a cura di Lucia Piana

Tutti gli apicoltori sanno che un miele troppo umido rischia di fermentare e di perdere così il suo valore commerciale. Da cosa dipende la fermentazione e come si può evitare? I parametri che influenzano la fermentazione del miele sono stati studiati dal Laboratoire de Brasserie et des Industries Alimentaires dell'U.C.L.. Vengono qui presentati i risultati di questo lavoro.

Generalmente, i microrganismi non si sviluppano nel miele. I mieli contengono delle inibisse che impediscono lo sviluppo della maggior parte dei microrganismi. Inoltre, il miele presenta una pressione osmotica elevata. Questa pressione è dovuta a una differenza di concentrazione tra due mezzi separati da una membrana semipermeabile. Nel nostro caso è la pressione esercitata alla superficie dei lieviti, legata alla differenza di concentrazione in zuccheri tra il miele e l'interno della cellula del lievito. Se la parete semipermeabile di quest'ultimo non è abbastanza resistente, scoppierà. Esistono tuttavia alcuni lieviti che resistono a pressioni osmotiche elevate e vengono chiamati lieviti osmofili. Molti di questi sono stati identificati nel miele. Alcuni di questi lieviti sono causa, in alcune condizioni particolari, della fermentazione.
Praticamente, perché la fermentazione si sviluppi devono essere riunite diverse condizioni favorevoli:
- una attività dell'acqua compresa tra 0,60 e 0,66;
- la presenza di lieviti osmofili viventi in quantità sufficiente;
- una temperatura (optimum = 25°C circa) e un pH (optimum = 4,5 - 6,2) favorevoli;
Il pH del miele varia tra 3,5 e 4,5. Questi valori, tuttavia, non sono abbastanza distanti dall' optimum per evitare la fermentazione. In una stanza d'abitazione i primi due parametri elencati sono quelli che influenzeranno quindi tutto il processo. A titolo di esempio, Cremer e Riedmann (1965) hanno mostrato che lo stoccaggio di un miele durante un anno a temperatura ambiente aumentava il suo contenuto in alcoli (indicatore di fermentazione). Questi ultimi potrebbero provenire dalla degradazione degli aminoacidi o degli zuccheri da parte dei lieviti osmofili. L'attività del lieviti potrebbe ugualmente essere all'origine dell'apparizione di aromi sgradevoli durante la conservazione del prodotto.

Rischi legati all'acqua
Tutti gli apicoltori sono coscienti dell'importanza del contenuto d'acqua per la conservazione dei loro mieli. Se si analizza il parametro che influenza effettivamente i meccanismi di degradazione, si constata che è l'acqua realmente disponibile per le reazioni chimiche e biologiche che è importante. Nel miele, una parte dell'acqua è legata alle molecole di zucchero e non può quindi intervenire nelle reazioni. Si utilizza il termine di attività dell'acqua (aw) per designare l'acqua libera. La conoscenza della relazione esistente tra l'aw e il contenuto d'acqua è importante. Questa ci permette di definire un limite di umidità al di là del quale sono possibili le alterazioni dovute ai lieviti osmofili. Il campo dell'attività dei lieviti osmofili si estende tra 0,60 e 0,65 di aw L'abbassamento dell'attività dell'acqua al di sotto del valore ottimale aumenta il periodo di latenza, diminuisce la velocità di crescita e diminuisce il numero massimo di cellule viventi.
La tabella n. 1 ci dà l'evoluzione della percentuale di mieli in cui l'attività dell'acqua è superiore a 0,6, in funzione dell'umidità.
Vediamo che il campo d'attività dell'acqua compreso tra 0,6 e 0,65 corrisponde ai tenori di umidità compresi tra 17,2 e 21,2 %. Tra 17 e 19 % d'acqua è quindi indispensabile affidarsi unicamente dei valori d'aw. I mieli che hanno un tenore d'umidità superiore a 19% possiedono sempre, invece, una aw critica. Questi risultati confermano quelli di White (1975) e Lochhead (1933) che avevano definito un limite di umidità critica al di sopra della quale le quantità di lieviti (colonie) dovevano essere molto limitate (da 17,1 a 18%: < 1000/g; da 18,1 a 19%: < 10/g; da 19,1 a 20%: < 1/g) per evitare la fermentazione.
Notiamo che noi abbiamo studiato anche mieli (con un tenore in umidità > 21%) in cui l'attività dell'acqua era superiore a 0,65, considerata come massima nella bibliografia

Tabella 1 - Evoluzione della percentuale di mieti con aw superiore a 0,6 in funzione del contenuto di umidità.

Presenza di lieviti osmofili
Analizziamo ora il secondo parametro attraverso un campionamento di 20 mieli del commercio.
Questo si rende necessario per valutare lo stato microbiologico di questi mieli. Nel nostro studio sono stati utilizzati tre terreni di coltura. I primi due permettono d'isolare i lieviti, il terzo isola i batteri. Tutti e tre i mezzi sono sterilizzati per 20 minuti a 115°C. L'analisi microbiologica ha rivelato la presenza di tre tipi di lieviti (numero totale di colonie vicino a 1000/g) (Callens, 1992). I risultati di alcuni mieli sono riportati nelle tabelle 2 e 3 (Bouseta., 1990).
Per determinare l'impatto della conservazione sulla qualità del miele, il conteggio delle cellule di lieviti non è sufficiente; bisogna anche identificare i lieviti e verificare se sono implicati nei meccanismi di degradazione biochimica degli aminoacidi e degli zuccheri fermentescibili.
L'identificazione dei lieviti, realizzata al Laboratoire de Mycologie Systématique et Appliquée (Professor G. Hennebert) ha richiesto un lavoro molto impegnativo.
Deve essere effettuata su un ceppo in coltura pura, precedentemente isolata su un mezzo adeguato (terreno già utilizzato senza aggiunta di inibitori della crescita batterica). In questo modo sono state isolate quattro specie nelle colonie bianche, rosse e nere descritte nelle tabelle 2 e 3. Questi lieviti sono stati in seguito inoculati in una serie di provette contenenti dei terreni specifici per i test di identificazione morfologica e metabolica. L'insieme dei test è indispensabile per poter identificare correttamente un lievito. I criteri di analisi sono raggruppati in 4 categorie: l'aspetto della coltura, la morfologia delle cellule vegetative, i caratteri sessuali e fisiologici. I nostri risultati permettono di identificare distintamente le seguenti quattro specie: Cryptococcus albidus, Trichosporon beigelii, Rhodotorula minuta, Debaryomyces hansenii. Secondo le prove metaboliche eseguite, solo Debaryomyces hansenii presenta test positivi per la fermentazione del glucosio, galattosio, saccarosio e cellobiosio. Tuttavia anche Trichosporon beigelii utilizza glucosio per la crescita se questo è presente in forte concentrazione (le tabelle con questi dati sono disponibili presso il CARI, su semplice domanda).
Debaryomyces hansenii è stato identificato in numero se derrate alimentari come il vino, la birra, il saké, il latte e la frutta (Lodder e Kreger-Van Rij, 1983). Cryptococcus albidus è stato identificato nel vino, nel saké, nel formaggio e nel polline (Skinner, 1983). La sua presenza nel miele potrebbe spiegarsi con l'incorporazione di granuli pollinici contaminati (Gilliam, 1975).

Tabella 2 - Conta dei lieviti sul terreno 1 (PDA: Potato Dextrose Agar) + difenile + cloramfenicolo
7=montagna; 9=millefiori; 11=acacia; 20=agrumi; 29=agrumi; 35=rosmarino; 82=millefiori

Tabella 3 - Conta dei lieviti su terreno 2 (Estratto di malto 20g. + agar 20g + acqua distillata 1000 ml. Aggiustare il pH a 3,7 con acido tartarico. Aggiungere cloramfenicolo (300 mg/l) per l'inibizione dei batteri e propinato di calcio - soluzione al 5% -per l'inibizione delle muffe).

Evoluzione dei mieli
Ma in pratica, qual è l'influenza dell'attività dell'acqua sulla fermentazione del miele? Per saperlo abbiamo conservato a 28°C, per 180 giorni, 18 mieli che avevano una aw compresa tra 0,54 e 0,66. Lo sviluppo di composti volatili leggeri (soprattutto alcoli) da parte di questi mieli durante la conservazione è stata preso come indicatore di fermentazione.
Come avevamo previsto, i mieli con una attività dell'acqua inferiore a 0,60 non hanno mostrato una produzione significativa di etanolo e degli altri alcoli. Nel mieli con aw superiore a 0,60. invece, è stata constatato un aumento significativo del contenuto in alcoli. Per alcuni mieli molto umidi (umidità % di 20,2 e 21,1 e aw di 0,63), la fermentazione (caratterizzata da una produzione di etanolo di 46 - 172 ppm) è evidente. Per altri la produzione di alcol è meno marcata. Certi mieli, nelle condizioni di fermentazione, producono invece pochissimo alcol.

In futuro
Abbiamo visto che i mieli dovrebbero avere una attività dell'acqua inferiore a 0,60 per non presentare rischi di fermentazione. In queste condizioni il metabolismo dei lieviti osmofili viene inibito. Se si vuole migliorare la qualità dei mieli e assicurare loro una buona, conservazione, sarebbe quindi indispensabile tener conto dell'attività dell'acqua per i mieli che presentano un contenuto d'acqua superiore al 17%. Tra 17 e 19%, un numero crescente di mieli presenta un'attività dell'acqua superiore a 0,6 e, al di là del 19%, tutti i mieli immagazzinati a temperatura ambiente per 6 mesi possono fermentare.
A livello di analisi, sarebbe interessante poter provare la presenza di lieviti osmofili nei mieli in cui l'attività dell'acqua supera 0,6, in modo da classificarli come mieli a rischio. Questo suppone che siano realizzati preventivamente studi complementari. Dovrebbe essere messa a punto una tecnica rapida e precisa di isolamento e identificazione dei lieviti osmofili. Bisognerebbe, per esempio, poter differenziare i lieviti osmofili nelle colonie bianche (dalle quali è stato isolato Debaryomyces hansenii). Inoltre, dovrebbe essere studiata su un numero più grande di mieli la correlazione tra produzione di alcoli, la presenza di una aw superiore a 0,6 e la presenza di lieviti fermentanti. Tutto questo, disgraziatamente è molto lungo e costoso.
Per l'apicoltore, l'obiettivo da raggiungere è quindi di produrre mieli in cui l'attività dell'acqua è bassa.

Ringraziamenti
I nostri ringraziamenti sono rivolti al professar G. Hennebert (Laboratoire de Mycologie Systématique Appliquée, U.C.L.) che ci ha permesso di realizzare l'identificazione dei lieviti nel suo laboratorio.

Il Commento
La fermentazione del miele è un fenomeno conosciuto da tutti gli apicoltori e da tutti i tecnici che si occupano di miele. Ciononostante le informazioni di tipo scientifico su questo tipo di alterazione sono molto limitate. Parlando di fermentazione si fa riferimento all'unico studio organico effettuato sull'argomento nell'ormai lontano 1933 da Lochhead, citato anche in questa ricerca. Probabilmente alla base del disinteresse della ricerca scientifica sull'argomento vi è il fatto che il problema, pur essendo importante, può essere risolto in maniera definitiva abbassando il contenuto d'acqua al di sotto del limite di sicurezza assoluta (17%) o inattivando i lieviti con un trattamento termico. Conoscere il nome, le caratteristiche e l'origine dei microrganismi responsabili della fermentazione, sapere perché un miele con 17,8% d'acqua è fermentato e non lo è invece un altro con il 19% può sembrare più una curiosità da naturalisti che una preoccupazione dei tecnologi alimentari. Inoltre il problema riguarda, nei nostri climi e nelle nostre condizioni di produzione, solo una quantità limitata (meno del 20% del miele italiano) di un prodotto che possiamo considerare marginale rispetto alle altre derrate alimentari. Questo tipo di degradazione non è però un'esclusiva del miele: altri alimenti a forte concentrazione zuccherina hanno gli stessi problemi e i lieviti osmofili (o osmotolleranti) sono conosciuti e studiati nell'industria degli zuccheri (estrazione dello zucchero e produzione di sciroppi zuccherini per uso alimentare), delle conserve di frutta (marmellate, frutta secca) e in confetteria industriale (caramelle e affini). Le informazioni acquisite in questi campi possono essere in parte applicate al miele e l'approccio adottato nel presente articolo ne è un esempio.
In realtà l'articolo ha un taglio misto, metà scientifico e metà tecnico-divulgativo e necessita forse di qualche complemento per rispondere alla domanda che fa da titolo. Nel miele lo svilupparsi o meno della fermentazione è in relazione con diversi fattori: da una parte quelli legati alle caratteristiche del prodotto e alle modalità di conservazione (quantità di acqua libera disponibile, presenza di sostanze nutritive, pH, eventuale presenza di sostanze che inibiscono la crescita dei lieviti, temperatura) dall'altra la quantità e le caratteristiche dei lieviti. Questi, se il mezzo presenta le caratteristiche necessarie, si moltiplicano e consumano gli zuccheri del miele, rigettando all'esterno i prodotti del metabolismo (anidride carbonica, alcol, acidi), provocando i danni conosciuti.
I lieviti osmofili, responsabili della fermentazione, sono gli unici microrganismi che possono svilupparsi in un mezzo che ha le caratteristiche del miele. Sono sempre presenti nel miele in quanto derivano dal nettare e dalle altre materie zuccherine raccolte dalle api e, soprattutto, dall'interno dell'alveare, dove sono particolarmente abbondanti soprattutto se ci sono, o vengono introdotti, residui di miele fermentato (per esempio scorte dell'anno precedente che sono rimaste esposte all'aria umida in quanto contenute in favi non presidiati dalle api o residui presenti nei favi da melario). Altra possibile fonte di contaminazione, sono i residui di miele vecchio che possono essere presenti nei materiali che si utilizzano per l'estrazione e la lavorazione. La quantità iniziale di lieviti è importante in quanto, poiché questi si sviluppano in maniera abbastanza lenta, un piccolo numero di lieviti impiegherà molto tempo per raggiungere una quantità tale da produrre danni evidenti nel prodotto, assicurando così una conservazione sufficientemente prolungata. Le caratteristiche morfologiche e biochimiche dei lieviti del miele sono poco conosciute, ma la maggior parte degli studi sull'argomento identifica i lieviti più comuni nel miele con ceppi che oggi sono raggruppati sotto il nome specifico di Zygosaccharomy'ces rouxii (la sistematica in questo campo cambia rapidamente). Sorprendentemente questa specie non è tra quelle identificate nello studio qui riportato. Questi lieviti possono essere inattivati con un breve riscaldamento a 60°C e questo fatto è alla base delle tecniche di pastorizzazione per la conservazione del miele.
Per quello che riguarda le caratteristiche del miele, conosciamo tutti il ruolo giocato dal contenuto d'acqua: più questo è elevato, maggiore è il rischio di fermentazione. L'articolo propone un parametro diverso dal contenuto percentuale di acqua, normalmente utilizzato. L'attività dell'acqua è il parametro che viene usato in microbiologia industriale e tecnologia alimentare per predire la suscettibilità di un alimento all'attacco microbico. Misura la quantità d'acqua effettivamente disponibile in un prodotto alimentare, quella che non è impegnata in leganti di coordinamento: nell'acqua pura è 1. Nel miele varia tra 0,58 e 0,74 soprattutto a seconda del contenuto d'acqua ma anche della composizione zuccherina e quindi dell'origine botanica e dello stato fisico del miele (liquido o cristallizzato). In effetti, come avevamo già proposto alcuni anni fa in un lavoro sull'argomento, questo parametro potrebbe sostituire la misura dell'umidità percentuale, con il vantaggio di avere una relazione più diretta con la conservabilità del prodotto. Al di sotto del 17,0 % tutti i mieli hanno un attività dell'acqua tale per cui lo sviluppo dei lieviti non è possibile, ma al di sopra di questo valore l'acqua effettivamente disponibile può essere o meno sufficiente a permettere la fermentazione: soprattutto in questi casi la misura di aw potrebbe essere utile a prevedere la conservabilità. La cristallizzazione del miele produce un aumento dell'acqua libera rispetto all'equivalente allo stato liquido: la fermentazione è quindi più probabile nel miele cristallizzato che in quello liquido. Le altre sostanze contenute nel miele possono avere un ruolo, anche se generalmente non determinante, nel favorire o inibire la fermentazione. Così il pH, come ricordato nell'articolo, la presenza di piccole quantità di vitamine, sali minerali e sostanze azotate sono necessari per assicurare lo sviluppo dei lieviti e alcuni mieli possono esserne carenti. Al contrario alcune sostanze inibiscono lo sviluppo dei lieviti: per esempio le stesse sostanze che si formano con la fermentazione (alcoli, acidi) possono bloccare l'ulteriore procedere della fermentazione, le sostanze che si producono per degradazione degli zuccheri (fùrfùrale e analoghi), eventuali sostanze antimicrobiche di origine vegetale. La temperatura, oltre ad avere un effetto sull'attività dell'acqua e sulla cristallizzazione, influenza la moltiplicazione dei lieviti, come ricordato nell'articolo.
Abbiamo così passato in rassegna tutti i parametri che influenzano la fermentazione. Gli autori dell'articolo suggeriscono di prevedere la fermentazione procedendo ad analisi microbiologiche sui mieli con attività dell'acqua superiore a 0,6. Penso che tutti i mieli con aw superiore a un certo limite (che però situerei più vicino a 0,65 che non a 0,60) debbano essere considerati prodotti a rischio, indipendentemente dalla presenza di lieviti. Tali prodotti devono essere consumati rapidamente o, più opportunamente, concentrati a un valore di aw di sicurezza (oppure pastorizzati o conservati a temperatura di frigorifero, secondo i casi).
Molto più interessante, dal punto di vista pratico, sarebbe invece dar corso all'altra ricerca suggerita dagli autori. Oggi infatti, pur esistendo un divieto a livello europeo nella commercializzazione del miele fermentato per uso umano diretto, non vengono definiti i parametri coi quali tale difetto deve essere controllato. Occorre ricordare che tale divieto è dettato da una minor qualità organolettica e alimentare del prodotto fermentato rispetto a quello stabile e non da un possibile rischio per la salute. Visto che il prodotto fermentato può comunque presentare parametri fisico-chimici all'interno della norma prevista e non essendo contemplato alcun limite per le caratteristiche microbiologiche o microscopiche, il riconoscimento del miele fermentato viene affidato esclusivamente alla valutazione organolettica. Seppure un miele fortemente fermentato sia facilmente riconoscibile (schiuma, aspetto spugnoso, presenza di bolle di gas, odore e aroma alcolico e fruttato, sapore acido), non è chiaro se tale limitazione nella commercializzazione debba applicarsi anche ai mieli con una fermentazione meno sviluppata o a quelli in cui la fermentazione sia stata bloccata con un processo di concentrazione o di pastorizzazione. L'identificazione della relazione esistente tra la fermentazione evidenziabile organoletticamente, il contenuto di alcol o di altre sostanze che indicano lo sviluppo microbico, la quantità di lieviti osmofili viventi e l'aw. potrebbe suggerire un sistema di controllo più obiettivo di quello oggi possibile.